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II.5 Untersuchung der Mutanten

RhoG-Mutanten

Der Ausgangspunkt für die ersten Transglutaminierungsversuche war die Frage, ob die

Aminosäuren 65 und 71 entscheidend für die Substraterkennung durch DNT sind, ob also die

RhoA-Mutanten, die an diesen Positionen die äquivalenten Aminosäuren von RhoG enthalten,

keine Substrate mehr von DNT sein würden. Der Test von RhoA D65E und RhoA P71T

zeigte, dass diese Mutanten im Gegensatz zu RhoA Wildtyp nicht transglutaminiert werden

(Abb. D7). Da die Mutanten [γ−

S]GTP binden, also korrekt gefaltet sind, kann dieser Effekt

auf die ausgetauschte Aminosäure zurückgeführt werden.

Abb. D7: Transglutaminierung durch DNT

Kosubstrat: Monodansylcadaverin; der Versuch wurden zweimal mit gleichem Ergebnis durchgeführt; zweite

Positivkontrolle: RhoA K140T;

Das Ergebnis spricht dafür, dass die ausgetauschten Aminosäuren für die

Transglutaminierung durch DNT notwendig sind. Um zu untersuchen, ob sie ausreichend

sind, wurden die reziproken Mutanten von RhoG, RhoG E63D und RhoG T69P, getestet.

RhoG T69P wurde nicht exprimiert. RhoG E63D wurde im Transglutaminierungsversuch

untersucht. Diese Mutante wurde nicht von DNT transglutaminiert (nicht gezeigt, Anzahl der

Versuche mit gleichem Ergebnis: zweimal).

Um zu testen, ob ein Unterschied in der Substraterkennung durch DNT und CNF1 besteht,

wurden die Mutanten im Transglutaminierungsversuch mit CNF1 getestet (Abb. D8). Weder

RhoG Wildtyp noch die Mutante RhoG E63D wurden durch CNF1 transglutaminiert. Die

RhoA-Mutante RhoA D65E wurde, wie im Versuch mit DNT, im Gegensatz zu RhoA

Wildtyp nicht mehr von CNF1 transglutaminiert.

RhoA Wildtyp RhoA D65E RhoA P71T RhoA K140T

- + - + - + - + DNT

RhoA Wildtyp RhoA D65E RhoA P71T RhoA K140T

- + - + - + - + DNT

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