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Die Absorption der Proteinlösung wurde photometrisch bei 595 nm gegen einen Nullwert

gemessen und die Proteinkonzentration über folgende Formel berechnet:

Extinktion x Bradfordfaktor

= Proteinkonzentration

Volumen der Probe x 0,1

Der Bradfordfaktor wird mit Hilfe einer BSA-Eichkurve ermittelt.

1.3 Optische Bestimmung der Proteinkonzentration

Eine andere Methode zur Bestimmung der Proteinkonzentration ist die optische Bestimmung.

Hierzu wurde die Proteinlösung auf ein 12,5% SDS-Polyacrylamid-Gel aufgetragen und die

betreffende Proteinbande nach Färben, Entfärben und Trocknen mit Proteinbanden bekannter

Proteinkonzentrationen verglichen.

1.4 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese

Die diskontinuierliche SDS-PAGE wurde nach der Methode von Lämmli (1970)

durchgeführt. Die Auftrennung von Proteinen durch SDS-PAGE beruht auf der Wanderung

von geladenen Molekülen im elektrischen Feld.

Aufgrund ihrer Wanderung durch ein Polyacrylamidgitter können die Proteine geordnet nach

ihrer Masse aufgetrennt werden. Proteine mit niedrigem Molekulargewicht wandern im

elektrischen Feld schneller durch das Polyacrylamidgitter als solche mit höherem

Molekulargewicht. Die Porengröße des Gitters hängt vom Verhältnis zwischen

Acrylamidmonomeren und dem Vernetzer Methylenbisacrylamid ab und bestimmt den

Massenbereich, in dem die Auftrennung stattfindet. Für die in dieser Arbeit verwendeten

Proteine wurden 12,5%ige Trenngele verwendet.

Da die Wanderungseigenschaft von Proteinen neben der Masse auch von der Faltung und der

Ladung abhängt, müssen sie vor dem Auftragen auf das Gel denaturiert werden. Dazu wurden

die Proben mit SDS-Probenpuffer versetzt und für 5 Minuten auf 95°C erhitzt. Etwaige

Disulfidbrücken wurden durch das im Probenpuffer enthaltene DTT reduziert. Der Gellauf

erfolgte in einem glycinhaltigen Laufpuffer bei einer Stromstärke von 25-40 mA und dauerte

35-60 Minuten.

Als Referenz für das Molekulargewicht lief ein Marker mit Proteinen bekannten

Molekulargewichts auf einer Bahn des Gels mit.

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