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INHALTSVERZEICHNIS___________________________________________________II

II Methoden 29

II.1 Arbeiten mit Proteinen 29

1.1 Expression und Aufreinigung von GST-Fusions-

Proteinen 29

1.1.1 Expression in E. coli 29

1.1.2 Lyse der Bakterienzellen 30

1.1.3 Affinitätschromatographie 30

1.1.4 Glutathion-Freisetzung 30

1.1.5 Thrombinspaltung 31

1.1.6 Konzentration der Proteinlösung 31

1.2 Bestimmung von Proteinkonzentrationen nach Bradford 31

1.3 Optische Bestimmung der Proteinkonzentrationen 32

1.4 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese 32

1.5 Herstellung der Polyacrylamidgele 33

1.6 Proteinnachweis durch Immunoblot-Analyse 34

(Westernblot)

II.2 Tests der Substratspezifität 36

2.1 Auswahl der Konzentrationen für die

Toxin/Substrat-Interaktion 36

2.2 Transglutaminierung mit Monodansylcadaverin 36

2.3 Messung der Ammoniakfreisetzung 38

2.4 Nachweis der Motilitätsänderung im SDS-Gel 39

2.5 Messung der GTP-Bindung 40

2.6 Messung der GTPase-Aktivität 41

II.3 Arbeiten mit DNA 42

3.1 Zielgerichtete Mutagenese und

Polymerasekettenreaktion 42

3.2 Primer-Design 43

3.3 Plasmid-Präparation 43

3.4 DNA-Konzentrationsbestimmung und Abschätzung

der Qualität 43

3.5 Mutagenese-PCR 44

3.6 Dpn1-Verdau 44

3.7 Agarosegelelektrophorese 45

3.8 Herstellung kompetenter Bakterienzellen 45

3.9 Transformation 46

3.10 Kontrolle der Basensequenz 46

3.11 Konservierung transformierter E. coli Bakterien 48

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