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E3Switch DE3 Manuel d'utilisateur Page 57

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51
II DNT und CNF1
II.1 Substratspezifität von DNT
Das Rho-aktivierende Toxin DNT besitzt eine größere Transglutaminierungsaktivität als
Deamidierungsaktivität (Masuda, 2000). Es modifiziert Rho-GTPasen am Glutaminrest 63.
Zwei weitere Aminosäuren der Switch-II-Region, Arginin 68 und Leucin 72, sind für die
Transglutaminierung von RhoA durch DNT notwendig (Lerm, 1999a). Sie sind in allen
getesteten GTPasen vorhanden. Im Gegensatz zu CNF1 benötigt DNT für die
Substraterkennung außer den Aminosäuren 59 bis 78 der Switch-II-Region noch weitere
Strukturen der Rho-GTPase. Sowohl N- als auch C-terminale Anteile eines Rho-Proteins sind
für die Modifizierung durch DNT notwendig (Lerm, 1999a).
Die Substratspezifität von DNT wurde mit Hilfe des Transglutaminierungsexperiments
untersucht, bei dem das fluoreszierende Monodansylcadaverin als Kosubstrat dient. Der
Versuch wurde pro GTPase je dreimal durchgeführt, und die Fluoreszenz der Proteinbanden
wurde densitometrisch quantifiziert. Mittelwert und Standardabweichung der Quantifizierung
sind im Folgenden graphisch dargestellt.
RhoB, RhoC, Rac1, Cdc42 und TC10 (Abb. D2):
Die GTPasen RhoB, RhoC, Rac1, Cdc42
und TC10 werden durch DNT transglutaminiert. Die Modifizierung von TC10 und RhoC ist
schwächer als die von Cdc42 und RhoB.
Abb. D2: Transglutaminierung
durch DNT
Dargestellt ist die Trans-
glutaminierung der Rho-
GTPasen RhoB, RhoC, Rac1,
Cdc42 und TC10 durch DNT im
Vergleich zu RhoA. Kosubstrat
ist Monodansylcadaverin, als
Einheit dient die gemessene
Fluoreszenz in Prozent (RhoA-
Fluoreszenz = 100%; 2 µg GST-
RhoA; Verhältnis von ∆DNT zu
GTPase: 1 : 2; Inkubation: 30
min bei 29°C).
R
h
o
A
R
h
o
B
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C
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d
c
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