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Die natürliche Kompetenz von E. coli ist gering und wird durch die folgende Methode

erheblich gesteigert:

Aus 5 ml einer Übernachtkultur, angeimpft mit TG1 oder BL21 Zellen aus vorher auf gleiche

Weise hergestellten Glycerin-Kulturen, wurden 500 ml einer Hauptkultur hergestellt. Diese

wurde bis zum Erreichen einer optischen Dichte von 0,3-0,5 bei 37°C und 200 rpm im

Schüttler inkubiert und anschließend 20 Minuten auf Eis a/jointfilesconvert/377385/bgekühlt. Die Zellen wurden 5

Minuten lang bei 12000 rpm pelletiert, um dann in TSS-Medium mit 10% Glycerin

resuspendiert zu werden.

Die Zellsuspension wurde auf Eis in 1,5 ml Eppendorf Reaktionsgefäße aliquotiert und dann

bei -80°C eingefroren.

3.9 Transformation

Die Aufnahme der mutierten Plasmid-DNA in Bakterienzellen wird mit Hilfe eines

Hitzeschocks erreicht.

125 µl TG1 oder BL21 E. coli Zellen wurden auf Eis aufgetaut. 2 µl der in der Mutagenese-

PCR amplifizierten Plasmid-DNA wurden hinzu gegeben und die Bakterienzellen dann

zunächst für 20 Minuten auf Eis bei 4°C belassen. Anschließend wurden die Proben für 90 s

bei 42°C inkubiert und danach für weitere 5 Minuten auf Eis gestellt.

Bevor die Zellen auf Agarplatten ausgestrichen wurden, wurden sie in 400 µl SOC-Medium

zur Vermehrung 1 Stunde bei 37°C im Schüttler inkubiert. Da auf dem pGEX-Vektorplasmid

ein Ampicillin-Resistenz-Gen kodiert ist, konnten auf den Agarplatten über Nacht nur

Bakterien wachsen, die das Plasmid besaßen.

Von den gewachsenen Kolonien wurden am nächsten Tag einige herausgepickt, auf eine

zweite Agarplatte („Masterplate“) aufgebracht und wieder über Nacht wachsen gelassen. Für

die DNA-Sequenzierung und alle weiteren Verwendungen wurden die Bakterien von der

Masterplate benutzt.

3.10 Kontrolle der Basensequenz

Jede Mutation, die im Rahmen dieser Arbeit vorgenommen wurde, wurde durch die

Bestimmung der Basensequenz bestätigt.

Die Sequenzierung der Plasmid-DNA geschah mit Hilfe des „ABI PRISM TM BigDye

Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kits“ der Firma Perkin Elmer. Die Methode

basiert auf einer modifizierten Form der Kettenabbruchmethode, die von Sanger 1977

beschrieben wurde.

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