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II.2 Tests der Substratspezifität

2.1 Auswahl der Konzentrationen für die Reaktionsansätze

In dieser Arbeit ging es um die Frage, ob eine Interaktion zwischen Toxin und GTPase

stattfindet. Ausschlaggebend für die Wahl der Konzentrationen der Reaktionspartner war vor

allem, dass genügend Substrat zur Detektion eines Signals, sowie ausreichend aktives Toxin

für die Modifikation vorhanden war.

Vom Toxin DNT wurde z.B. im Verhältnis zum Substrat sehr viel zugegeben (1 : 2), weil die

Aktivität von DNT nicht immer optimal war. Für den Nachweis der Motilitätsänderung im

SDS-Gel wurde im Verhältnis zur GTPase weniger CNF1 (1 : 20) benötigt als für die

Transglutaminierung mit Monodansylcadaverin (1 : 10). Für die Messung der

Ammoniakfreisetzung erwies sich eine noch geringere Toxinkonzentration (1 : 50) als

günstiger für den Nachweis der Reaktion.

2.2 Transglutaminierung mit Monodansylcadaverin

Für den Nachweis einer Transglutaminierung der Rho-Proteine wurde Monodansylcadaverin

als Kosubstrat verwendet. Monodansylcadaverin ist ein fluoreszierendes primäres Amin,

dessen Einbau in ein Protein man mit Hilfe von UV-Licht nachweisen kann. Abb. C2 zeigt ein

Schema der Nachweisreaktion.

Abb. C2: Transglutaminierungsreaktion

Das fluoresierende primäre Amin Monodansylcadaverin wird bei der Transglutaminierungsreaktion unter

Abspaltung von Ammoniak am Glutamin 63 des Rho-Proteins angehängt und mit Hilfe von UV-Licht im SDS-

Gel nachgewiesen.

NH2

1 2 ... 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 ... 93 94

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