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Für die zielgerichtete Mutagenese werden zwei komplementäre Primer verwendet, die die

erwünschte Mutation enthalten. In einer Mutagenese-PCR, die mit Hilfe des „Quik-Change

site-directed mutagenesis Kit“ durchgeführt wurde, wird die mutierte Variante der Plasmid-

DNA durch mehrfache Wiederholung des oben beschriebenen Reaktionsablaufes vermehrt.

Die Zielgerichtete Mutagenese beinhaltet folgende Schritte:

• Primer Design

• Plasmid-Präparation

• Mutagenese-PCR

• Dpn1-Verdau

• Transformation von Bakterienzellen

3.2 Primer Design

Wie oben beschrieben bilden Primer, die eine Mutation enthalten, die Grundlage für die

Herstellung von mutierten Rho-Proteinen. Beim Entwurf der Primer wurde darauf geachtet,

dass sich die erwünschte Mutation in der Mitte des Primers befand und der Primer insgesamt

ca. 25-30 Basenpaare lang war.

3.3 Plasmid-Präparation

Die Präparation der Plasmid-DNA für die Mutagenese-PCR wurde nach der Anleitung des

„E.Z.N.A. Plasmid Miniprep Kit I“ durchgeführt.

3.4 DNA-Konzentrationsbestimmung und Abschätzung der Qualität

Die Quantifizierung der Plasmid-DNA erfolgte im Spektrometer bei 260, 280 und 230 nm.

Dafür wurden je 5 µl DNA-Lösung in 495 µl H

O gegeben und gegen einen Nullwert von 500

µl H

O gemessen. Eine Absorption von 1,0 bei 260 nm entspricht einer Konzentration von 50

µg DNA/ml. Die Konzentration kann nach der Formel:

DNA-Konzentration (µg DNA/ml) = Absorption 260 x 50 x Verdünnungsfaktor

berechnet werden.

Außerdem wurden zur Abschätzung der Qualität der Plasmid-DNA die 260/280-Ratio und die

230/260-Ratio berechnet. Sie dienen als Maße für die Reinheit der Plasmid-DNA. Eine

260/280-Ratio unter 1,6 spricht für Protein- oder Phenolreste, Werte über 2,0 deuten auf

RNA-Reste hin. Werte über 0,9 in der 230/260-Ratio bedeuten, dass Zuckerreste in der

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