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Lösung vorhanden sind. Auf diese Weise konnte Plasmid-DNA von guter Qualität

identifiziert und für die Versuche verwendet werden.

3.5 Mutagenese-PCR

Ein Ansatz für eine Mutagenese-PCR enthielt:

5 µl 10x Pfu-Polymerase-Puffer

1 µl dNTPs 10 mM (jedes 2,5 mM)

5 µl sense Primer 3 µM

5 µl antisense Primer 3 µM

1 µl Pfu-Polymerase (2,5 U/µl)

2 µl Template ca. 25 ng/µl

1 µl MgCl

100 mM

HPLC-H

O ad 50 µl

Die PCR-Zyklen waren wie folgt eingestellt:

Segment

Zeit Temperatur Vorgang Anzahl

1 30 s 95°C

Denaturierung

30 s

1 min

2 min / kb Plasmidlänge

95°C

50-60°C

68°C

Denaturierung

Annealing

Elongation

12-18x

unbegrenzt

4°C Konservierung

Als DNA-Polymerase kam in dieser Arbeit die Pfu-Polymerase zum Einsatz. Sie hat eine

Ablesegeschwindigkeit von ca. 550 Basenpaaren pro Minute. Gegenüber der klassischen Taq-

Polymerase zeichnet sich die Pfu-Polymerase durch eine ca. 10 mal höhere Ablesegenauigkeit

und eine deutlich höhere Temperaturstabilität aus.

Weil DNA-Polymerasen die Strangenden der synthetisierten DNA nicht verknüpfen können,

lag die DNA nach der Mutagenese-PCR strangförmig vor.

3.6 Dpn1-Verdau

Der Zweck des Dpn1-Verdaus ist die Zerstörung der parentalen Plasmid-DNA durch die

Endonuklease Dpn1 vor der Transformation. Die Plasmid-DNA fast aller E. coli Stämme ist

dam-methyliert, wohingegen die in der Mutagenese-PCR amplifizierte DNA, die die Mutation

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