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nacheinander 50 ml Waschpuffer und 5 ml Glutathion-Elutionspuffer gegeben. Das Eluat

wurde in 1,5 ml-Reaktionsgefäßen aufgefangen und bei Bedarf weiter eingeengt.

Batch-Methode

Für die zweite Variante der Elution wurden die Beads in 1,5 ml-Reaktionsgefäße überführt

und darin fünf Mal durch einminütige Zentrifugation mit Waschpuffer gewaschen.

Anschließend wurden sie 2x 10 min bei Raumtemperatur mit Glutathion-Elutionspuffer

inkubiert und nochmals zentrifugiert. Im Überstand befand sich das GST-Protein in Lösung.

1.1.5 Thrombinspaltung

Bei der Thrombinspaltung wird das rekombinante Protein gewonnen, indem der GST-Anhang

durch Thrombin a/jointfilesconvert/377385/bgespalten wird. Thrombingespaltene Proteine wurden nur für den „Shift-

Assay“ verwendet.

Die Beads wurden nach der Bindung des Proteins in 1,5 ml-Reaktionsgefäße überführt. Darin

wurden sie mit Waschpuffer fünf Mal gewaschen. Anschließend folgte eine 40-minütige

Inkubation mit Thrombinspaltpuffer bei Raumtemperatur. Das nun in der Lösung vorhandene

Thrombin wurde durch 10-minütiges Überkopfschütteln bei 4°C mit Benzamidin-Beads

gebunden, so dass nur noch das gewünschte Protein in Lösung vorhanden war. Die beiden

Schritte für die Elution wurden zweimal durchgeführt.

1.1.6 Konzentration der Proteinlösung

War die durch die Aufreinigung erzielte Proteinkonzentration nicht hoch genug, wurden die

Proteinlösungen mit Hilfe eines Vivaspin Concentrator Membransystems von Vivascience mit

einer Membranporengröße von 30 kDa konzentriert.

1.2 Bestimmung der Proteinkonzentration nach Bradford

Das von Bradford 1976 beschriebene Verfahren zur Bestimmung von Proteinkonzentrationen

beruht darauf, dass es nach Bindung von Proteinen an den Farbstoff Coomassie Brilliant Blue

G-250 zu einem Wechsel des Absorptionsmaximum von 465 nm auf 595 nm kommt. 5-20 µl

einer Proteinlösung wurden mit Aqua bidest. auf 800µl aufgefüllt und anschließend mit 200

µl Bradford-Reagenz versetzt.

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