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2.3 Messung der Ammoniakfreisetzung

Die Deamidierung der Rho-Proteine wurde anhand einer gekoppelten enzymatischen

Reaktion mit Hilfe eines Ammoniak-UV-Tests von Boehringer Mannheim nachgewiesen

(Abb. C3). Bei diesem Versuchsaufbau reagiert der bei der Deamidierung frei werdende

Ammoniak in einer zweiten Reaktion in Anwesenheit von Glutamat-Dehydrogenase (GlDH)

mit 2-Oxoglutarat und NADH.

Aus NADH entsteht dabei NAD

, so dass die NADH-Konzentration als Maß für den

freigewordenen Ammoniak dienen kann. Die Absorption wurde in einem

Fluoreszenzspektrometer mit einem Programm von FL Winlab gemessen.

Abb. C3: Nachweis der Ammoniakfreisetzung durch eine gekoppelte Reaktion

Der bei der Deamidierung frei werdende Ammoniak wird anhand einer gekoppelten Reaktion nachgewiesen. Er

reagiert in Anwesenheit von GlDH mit 2-Oxoglutarat und NADH, so dass L-Glutamat, NAD

und H

entstehen. Die Abnahme von NADH dient als Maß für den entstandenen Ammoniak.

Jeder Ansatz enthielt ∆CNF und GTPase im Verhältnis 1:50.

Ein Ansatz von 500 µl enthielt außerdem:

50 µl 10x-Transglutaminase-Puffer

166 µl P2*-Puffer

5 µl GlDH-Lösung

50 mM Tris/HCl pH 7,5 ad 500 µl.

Die Messung erfolgte in zwei Phasen, einer Äquilibrierungsphase und einer Reaktionsphase.

Für die Äquilibrierungsphase wurden alle Substanzen außer dem Toxin in eine Quarzküvette

gegeben und der Ansatz bei 37°C bis zum Erreichen eines konstanten Wertes vermessen.

Temperatureffekte sollten hierdurch vermieden werden. Durch Zugabe von CNF1 begann die

2. Reaktion

1. Reaktion

2. Reaktion

1. Reaktion

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